台大医院内科部／盛望徽
摘要
在临床医疗中，针对革兰氏阴性杆菌，特别是绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、Stenotrophomonas maltophilia、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)及肠内菌(Enterobacteriaceae)等的多重抗药性是一越来越急迫的问题。过去多重抗药性的发生被认为是由很多机转建构而成，但是近年来的研究发现在这些病原体内因性及后天的多重抗药性中，在菌体细胞膜上由一种3合体结构(trimer)所形成的多重药物输出帮浦系统可同时导致多种抗生素抗药性的发生，此药物输出帮浦广泛存在于革兰氏阴性杆菌及其他病原体，且在不同的细菌间其基因序列上可鉴定此三合体的药物输出帮浦系统属于同源性的蛋白结构(homologues)，它们可以促使微生物以ATP耗能方式或电解质离子能差将多种抗生素及有害物质输出菌体外，而得以适应恶劣的环境(如酸、碱、抗生素、胆盐等)，特别的是：这些系统也常常会对抗生物制剂(biocides;如洗手液或消毒剂)生成输出作用，当环境中使用大量的抗生素及抗生物制剂时，亦会筛选出此种多重抗药性的革兰氏阴性杆菌。由于此类药物输出帮浦系统对于各式各样的化学受质均可能有影响，一些新发展的化学药剂也会被此类输出系统排出，因此针对未来革兰氏阴性菌的治疗趋势，发明输出系统拮抗剂，将是一个重要的课题。
前言
自从一九二O年代佛莱明发现盘尼西林后，随着时代的进步，抗生素一个个如雨后春笋般被发掘出来，拯救了许多病菌感染患者，但由于长期大量的使用抗生素于医疗及相关畜牧业，抗药性的问题接踵而来。革兰氏阴性杆菌，特别是院内感染常见的绿脓杆菌，Stenotrophomonas maltophilia，鲍氏不动杆菌等非葡萄糖发酵性细菌更是与生俱来有多重抗药性的特质，因而在治疗上十分困难。另外近年来各类抗生素逐渐开发广泛应用于临床治疗及农牧业，故造成人类与动物物种高抗药性致病菌如大肠杆菌(Escherichia coli)，克来伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)也在增加，而此种多重抗药性革兰氏阴性杆菌在临床上已被报告可造成患者高致病率与高致死率。造成细菌抗药性的机转不外乎有三类：(一)分泌酵素直接破坏抗生素；(二)改变抗生素作用在菌体部位之结构而使抗生素无法接合；(三)藉由关闭孔道以减少药物自细胞膜外渗透(permeability)至菌体内，或发展一套药物输出帮浦(efflux pump)，依赖消耗ATP能量或使用钠-钾离子差能(gradient)，将抗生素自菌体内排出至菌体外，以减少抗生素堆积。这些细菌生成多重药物抗药性的原因，可能是细菌本身发生多次自发性突变(mutation)，或自外界不断交换及累积药物抗药性基因而来。但近年来微生物学家发现：细菌因环境改变而内因性表现抗生素输出帮浦基因，可能是促使细菌发展多重抗药的主要原因。本篇文章内容将探讨多重药物性输出帮浦在革兰氏阴性杆菌对抗药性的影响、多重抗药性输出帮浦之种类及其受质(substrates)、细菌如何藉由环境改变引发输出帮浦系统之活化以及药物输出帮浦对细菌的重要性。
| 一、多重抗药性输出帮浦的结构与其分类 |
| |
在许多革兰氏阴性杆菌的染色体中本来就带有此段输出帮浦基因但平日未表现，因此许多革兰氏阴性杆菌如Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii等先天即具有多重抗药性，一旦外界环境改变(如酸碱值、抗微生物制剂等)的介入，该菌为求适应环境，就会表现帮浦基因，这一段抗药基因也可藉由细菌接合以染色体片段(chromosome)或质体(plasmid)方式再传至其他菌种。细菌的多重药物输出帮浦，依其输出之药物种类及特性可区分为五大类：
| 1. |
MFS家族(major facilitator super family) |
| 2. |
ABC家族(ATP-binding cassette family) |
| 3. |
RND家族(resistance-nodulation division) |
| 4. |
SMR家族(small multi-drug resistance) |
| 5. |
MATE家族(multi-drug and toxic compound extrusion) |
其中最常见的是RND家族，且并不限定在革兰氏阴性杆菌，许多革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)也有此帮浦，而ABC帮浦家族主要在真核细胞如霉菌(fungus)或寄生虫(parasite)上，而其他MFS, MATE, SMR帮浦家族输出帮浦较为少见且引起之抗药性低，在临床上意义不大。典型的帮浦结构为2个外膜蛋白(outer-membrance protein)及1个细胞膜间质融合蛋白(periplasmic membrane fusion protein)所组成，除ABC帮浦家族是藉由水解ATP生成能量提供帮浦输出药物，其余帮浦家族是藉由钠、氢离子差能输出药物，图一表示革兰氏阴性杆菌各种不同多重抗药性输出帮浦之基本结构。
RND帮浦家族
临床上对抗生素及其他许多抗生物制剂而言，最常见也是最重要的就是RND帮浦家族。最早发现RND帮浦家族与革兰氏阴性杆菌fluoroquinolone之抗药性有关，但随后发现此帮浦可排出其他不同结构之抗生素(如aminoglycosides, tetracycline, β-lactams等)、抑生物制剂(如chlorhexidine，四级胺)、染剂(dyes)、清洁剂(detergents)、细菌代谢物质(metabolites)、有机溶剂(organic solvents)、毒性脂肪酸(toxic fatty acids)、胆盐(bile salts)。近年来在Pseudomonas aeruginosa亦发现RND帮浦(MexAB-OprM系统)可协助释放细菌毒素，在细菌致病性上扮演一个十分重要的角色。多重药物输出帮浦亦可排出一种称为homoserine lactones的物质，其主要功能是细菌间传递消息，与细菌之致病力及生存力亦有直接相关。
RND多重药物输出帮浦，不仅广泛存在于人类、动植物相关之细菌上，在许多非致病性细菌上也具有此帮浦。除Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii等非葡萄糖发酵革兰氏阴性杆菌具有外，陆续在Vibrio cholerae, Citrobacter freundii, Proteus vulgaris也发现RND药物输出帮浦，它们均与fluoroquinolone之抗药性有关。Escherichia coli, Neisseria gonorrheae, Legionella pneumophilia, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumonia, S. maltophilia, Serratia marcescens, Campylobacter jejuni等各类不同菌株亦发现此帮浦家族基因与tetracycline、macrolides及aminoglycosides之抗药性相关，并已定序。(表一陈述RND帮浦家族相关之发现，表二陈述非RND多重抗药性输出帮浦。)
|
| 二、抗生素(antibiotic)-抗生物制剂(biocide)之交叉抗药性(cross-resistance) |
| |
研究观察E. coli菌的多重药物输出帮浦AcrAB系统(属于RND家族，为三种膜蛋白组合AcrAB-TolC)与Pseudomonas aeruginosa菌Mex系统(MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN)显示这些帮浦不但会排出菌体内抗生素，也会排出一些抗生物制剂。这也说明医院或环境中过度使用抗生素及抗生物制剂(如清洁剂、洗手液、消毒液等)，亦可能同时筛选出具有此类帮浦之多重抗药细菌。虽然，使用清洁剂及洗手时消毒液浓度很高，细菌较不易存活，但是洗手后或环境清洁后残留了较低浓度的抗生物制剂，就容易筛选出此类多重抗药菌株。在实验中E.coli及Pseudomonas aeruginosa被证实可经由抑菌制剂筛选出变异菌株，藉着发展药物输出帮浦(如Acr帮浦系统或Mex帮浦系统)，而由原本单纯非抗药菌株转变为多重抗药性菌株。
|
| 三、多重抗药帮浦系统与其他抗药机转有加成作用 |
| |
前面已经提过革兰氏阴性杆菌抗药性的机转有一部分是藉由胞膜通道蛋白关闭，减少药物进入菌体；另外已经进入菌体的抗生素，可藉由抗药帮浦再将抗生素打出菌体外。在研究中证实；多重抗药帮浦膜蛋白与胞膜孔道蛋白(porins)的基因调控可以互相协同，一方面表现帮浦基因排出抗生素，一方面关闭孔道蛋白使抗生素无法再进入，而达到加强菌体抵抗微生物制剂的能力。另外，在E.coli MarA多重抗药帮浦基因的研究中发现：当细菌遭遇fluoroquinolone抗生素环境时，细菌会发展AcrAB多重抗药帮浦，同时也会加强在fluoroquinolone标的位置基因(target site)DNA gyrase gene的突变(mutation)，而使fluoroquinolone无法接合于标的酵素，使抗药性明显上升数十倍。
|
| 四、如何克服多重药物输出帮浦引起之多重抗药性 |
| |
当前有两个方面可达到克服多重药物输出帮浦引起之抗药性：
1.发展帮浦抑制剂，直接抑制帮浦作用。
2.改变抗生素结构，使抗生素不容易成为多重抗药性帮浦之受质。
当前针对细菌之抗药性，已有多种帮浦抑制剂被开发出来，且实验中证实可有效抑制药物输出帮浦之作用，但仍未有临床药物使用之经验；另外，新一类glycylcyline(tigecycline, GAR-936)抗生素，虽然开发源自tetracycline(四环霉素)，但实验设计中改变化学结构证实tigecycline不会被E.coli及Pseudomonas aeruginosa之多重抗药帮浦排出，因而对于多重抗药性菌株如S. maltophilia及A. baumannii具有不错之疗效；但，对于P. aeruginosa某些菌株的MexAB-OprM, MexCD-OprJ及Mex XY-OprM帮浦系统，此药仍会被打出菌体外。由于多重药物输出帮浦作用的药物范围很广，因此，新的微生物制剂或尚未开发的抗生素均有可能仍是此类多重药物输出帮浦之受质而无法杀死具有某些特异多重抗药帮浦系统之细菌。因此持续开发帮浦拮抗剂仍然十分重要。其他可抑制帮浦系统可能的机制还有：j针对此帮浦蛋白开发治疗性疫苗k离子性抗菌生?(cationic peptides)或噬菌体(phages)，直接破坏帮浦蛋白。
|
| 五、细菌多重药物输出帮浦系统在自然界的作用 |
| |
细菌究竟为何会发展多重药物输出帮浦？猜测中的原因很多：如前所述在Pseudomonas aeruginosa的Mex系统(Mex XY-OprM)可输出多种抗生素(如erythromycin, tetracycline, gentamicin)以及抗生物制剂(如实验室常用的rhodamine 6G dye, acriflavine, ethidium bromide, 四级胺消毒剂如benzallcon chloride，及洗手液chlorhexidine)，可能是Pseudomonas藉由在医院或实验室中的环境影响基因调控而发展帮浦系统以抵抗恶劣环境而适合生存；另外，如E.coli的AcrAB帮浦系统，可排出肠内常有的毒性脂肪酸(toxic fatty acids)及胆盐(bile salts)，藉此可保护E.coli在人体肠内环境生存而不被此类毒性物质所影响，且E.coli可以很经济的利用一种帮浦系统就排出多种毒性物质。输出帮浦另外一个功能是：排出细菌的中间代谢产物或菌体内之废物。在E.coli的AcrAB系统及Pseudomonas的MexAB系统可排出细菌代谢氧化还原脂蛋白isoflavanoids物质。由于前述革兰氏阴性杆菌的RND家族帮浦系统很普遍存在于各菌种，且蛋白序列同源性(homology)很高；因此推断药物输出帮浦系统广泛存在于革兰氏阴性杆菌的原始作用，可能是源于细菌本身排出菌体内代谢产物的自然机制转变而来。 |
结论
多重抗药性革兰氏阴性杆菌是当前临床上治疗很棘手的问题，其中常见的原因是细菌发展出多重药物输出帮浦系统，此输出帮浦广泛存在于多种革兰氏阴性杆菌中，且其蛋白具有同源性，原始目的可能是细菌为求适应于不易生存的环境(环境压力)及为排出中间代谢产物或毒害物质而形成。这种帮浦不但可以将进入菌体内的多种化学结构相异的抗生素打出，也可排出抗生物制剂，另外，帮浦系统基因亦可协同调控其他抗药性基因而使抗药性提高数十倍。使用抗菌制剂过后残余的洗手液及消毒液浓度亦可引发药物输出帮浦活化而导致筛选出多重抗药性细菌。由于多种药物输出帮浦系统可以作用于许多化学结构迥异之抗菌物质，因此开发新的药物时，有可能成为此帮浦系统之受质而失去抗菌作用。探讨多重药物输出帮浦之结构及基因调控，以及开发帮浦抑制剂已成为现代抗菌治疗上的一大挑战。
表一、各种不同革兰氏阴性杆菌之RND多重抗药性输出帮浦(仅列临床上常见细菌) |
细菌 |
|
|
可输出受质 |
|
|
|
| Acinetobacter baumannii |
AdeA |
AdeB |
AdeC |
adeST |
AG, CX,TC, ER, CM, TP, FQ
|
| Burkholderia cepacia |
CeoA |
CeoB |
OpcM |
|
CM, CP, TP |
| Enterobacter aerogenes |
AcrA |
AcrB |
TolC |
acrR |
FQ, CM,TC, ACR, NOV, SDS, BS |
| Escherichia coli |
AcrA
AcrE
AcrA
|
AcrB
AcrF
AcrD
|
TolC
TolC
TolC
|
acrR
marA
robA
soxS
sdiA
|
AH, BA, BL,NV, ER, FU,
FQ, TC, CM,
EB,AC, CV, SDS
TX, BS, TS, PO, FA,
MX, LN,
AG, RD
|
| Hemophilas influenzae |
AcrA |
AcrB |
- |
- |
RF, ER, NV
EB, AC, CV, SDS
|
| Klebsiella penumoniae |
AcrA |
AcrB |
- |
acrR |
FQ |
Nesseria genorrheae
Nesseria meningitidis
|
MtrC |
MtrD |
MtrE |
mtrR
mtrA
|
AZ, ML, RF
PN, TX, CV, CP
|
| Proteus mirabilis |
AcrA |
AcrB |
- |
acrR |
TG, MN, CP, NV
CM, ER, EB, AC, TP
SDS
|
| Pseudomonas aeruginosa |
MexA
MexC
MexE
MexX
MexJ
|
MexB
MexD
MexF
MexY
MexK
|
OprM
OprJ
OprN
OprM
OprM
|
MexR
nfxB
MexT
MexZ
MexL
|
BL, FQ, CM, NV, TP, TG, SM, EB, AC, CV, SDS, AH, HL, CL, TL, IR, TS, TPP, RD |
| Salmonella |
AcrA |
AcrB |
TolC |
acrR |
BS, SDS, DOC, CH, TX, CV, AC, FA, NV, ER, RF, TC, CM, NOR, NAL, BL, FQ |
可输出受质缩写:
AC, acriflavine; ACR, acridines; AG, aminoglycosides; AH, aromatic hydrocarbons; AP, ampicillin; AQDS, anthaquinone-2,6-disulphonate; AZ, azithromycin; BA, benzalkonium; BL,  -lactams; BS, bile salts; CB, carbenicillin; CH, cholate; CL, cerulenin; CM, chloramphenicol; CP, ciprofloxacin; CV, crystal violet; CX, cefotaxime; DOC, deoxycholate; DOX, doxyrubicin; EB, ethidium bromide; ER, erythromycin; FA, fatty acids; FU, fusaric acid; FQ, fluoroquinolones; GN, gentamicin; HL, homoserine lactones; IR, irgasan; LN, linezolid; ML, macrolides; MN, minocycline; MX, methotrexate; NAL, nalidixic acid; NOR, norfloxacin; NV, novobiocin; PM, puromycin; PN, penicillin; PO, pine oil; RD, rhodamine; RF, rifampicin; SDS, sodium dodecyl sulphate; SM, sulphonamides; ST, streptomycin; TC, tetracycline; TG, tigecycline; TL, thiolactomycin; TO, toluene; TS, triclosan; TP, trimethoprim; TPP, tetraphenyl phosphonium; TX, Triton X-100; VA, vanadium.
| 表二、非RND多重抗药性输出帮浦 |
| 细菌 |
输出帮浦名称 |
调控基因 |
可输出受质 |
ABC
|
MATE |
SMR |
MFS |
|
Bacteroides fragilis |
BexA |
- |
NorA |
- |
- |
NOR, EB, PM, FQ, EB |
| Burkholderia cepacia |
- |
NorM |
BcrA |
- |
- |
TC, NAL |
| Escherichia coli |
- |
YdhE(NorM) |
|
|
|
NAL, PMA, HU, TL, EB, ACR, MPP, MV, TC, TPP, AG, BA, CM, DM, EB, ER, FQ, PTG, PM, RD, RF, TC, TPP |
| Nesseria gonorrhoeae |
- |
NorM |
- |
- |
- |
EB, AC, NOR, CP, BA |
| Nesseria meningitidis |
- |
NorM |
- |
- |
- |
EB, AC, NOR, CP, BA |
| Pseudomonas aeruginosa |
- |
- |
- |
EmrE |
- |
EB, ACR, MV, AG |
| Vibrio cholera |
- |
NorM |
VceB |
- |
- |
DOC, CCCP,
CM, ER, PMA, PCP, NAL, NOR, CP, AG, EB |
可输出受质缩写:
AC, acriflavine; ACR, acridines; AG, aminoglycosides; BA, benzalkonium; BER, berberine; CCCP, carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone; CM, chloramphenicol; CP, ciprofloxacin; CV, crystal violet; DM, daunomycin; DOC, deoxycholate; EB, ethidium bromide; ER, erythromycin; FQ, fluoroquinolones; GN, gentamicin; HU, hydrophobic uncouplers; IPTG, isopropyl--D-thiogalactopyranoside; MPP, methyltriphenylphosphonium; MV, methyl vialogen; NAL, nalidixic acid; NOR, norfloxacin; PCP, pentachlorophenol; PF, proflavin; PM, puromycin; PMA, phenylmercuric acetate; QAC, quaternary ammonium compounds; RD, rhodamine; RF, rifampicin; TC, tetracycline; TL, thiolactomycin; TPC, tetraphenylarsonium chloride; TPP, tetraphenyl phosphonium
| 图一革兰氏阴性杆菌各种不同多重抗药性输出帮浦之基本结构。外膜蛋白(OMF)，细胞膜间质融合蛋白(MFP)。 |
|
参考资料
- Waterer GW, Wunderink RG.. Increasing threat of Gram-negative bacteria. Crit Care Med 2001; 29: N75-N81.
- Livermore DM. Bacterial resistance: origins, epidemiology, and impact. Clin Infect Dis 2003; 36: S11-S23.
- Niederman MS. Impact of antibiotic resistance on clinical outcomes and the cost of care. Crit Care Med 2001; 29: N114-N120.
- Poole K. Outer membranes and efflux: the path to multidrug resistance in gram-negative bacteria. Curr Pharm Biotechnol 2002; 264: 167-188.
- Webber MA, Piddock LJ. The importance of efflux pumps in bacterial antibiotic resistance. J Antimicrob Chemother 2003; 51:9-11.
- Pradel E, Pages JM. The AcrAB-TolC efflux pump contributes to multidrug resistance in the nosocomial pathogen Enterobacter aerogenes. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46: 2640-2643.
- Gayet S, Chollet R, Molle G, Pages JM, Chevalier J. Modification of outer membrane protein profile and evidence suggesting an active drug pump in Enterobacter aerogenes clinical strains. Antimicrob Agents Chemother 2003; 47:1555-1559.
- Mazzariol A, Zuliani J, Cornaglia G, Rossolini GM, Fontana R. AcrAB efflux system: expression and contribution to fluoroquinolone resistance in Klebsiella spp. Antimicrob Agents Chemother 2002: 46: 3984-3986.
- Cousin JS, Whittington WL, Roberts MC. Acquired macrolide resistance genes and the 1 bp deletion in the mtrR promoter in Neisseria gonorrhoeae. J Antimicrob Chemother 2003; 51: 131-133.
- Soto SM, Ruiz J, Mendoza MC, Vila J. In vitro fluoroquinolone-resistant mutants of Salmonella enterica serotype Enteritidis: analysis of mechanisms involved in resistance. Int J Antimicrob Agents 2003; 22: 537-540.
- Higgins PG, Fluit AC, Milatovic D, Verhoef J, Schmitz FJ. Mutations in GyrA, ParC, MexR and NfxB in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. Int Antimicrob Agents 2003; 21: 409-413.
- Sobel ML, McKay GA, Poole K. Contribution of the MexXY multidrug transporter to aminoglycoside resistance in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates. Antimicrob Agents Chemother 2003; 47: 3202-3207.
- Magnet S, Courvalin P, Lambert T. Resistance-nodulation-cell division-type efflux pump involved in aminoglycoside resistance in Acinetobacter baumannii strain BM4454. Antimicrob Agents Chemother 2001; 45: 3375-3380.
- Nishino K, Yamaguchi A. Analysis of a complete library of putative drug transporter genes in Escherichia coli. J Bacteriol 2001; 183: 5803-5812.
- Visalli MA, Murphy E, Projan SJ, Bradford PA. AcrAB multidrug efflux pump is associated with resuced levels of susceptibility to tigecycline (GAR-936) in Proteus mirabilis. Antimicrob Agents Chemother 2003; 47: 665-669.
- Nagakubo S, Nishino K, Hirata T, Yamaguchi A. The putative response regulator BaeR stimulates multidrug resistance of Escherichia coli via a novel multidrug exporter system, MdtABC. J Bacteriol 2002; 184: 4161-4167.
- Baranova N, Nikaido H. The BaeSR two-component regulatory system activates transcription of the yegMNOB (mdtABCD) transporter gene cluster in Escherichia coli and increases its resistance to novobiocin and deoxycholate. J Bacteriol 2002; 184: 4168-4176.
- Masuda N, Church GM. Escherichia coli gene expression responsive to levels of the response regulator EvgA. J Bacteriol 2002; 184: 6225-6234.
- Nishino K, Yamaguchi A. EvgA of the two-component signal transduction system modulates production of the YhiUV multidrug transporter in Escherichia coli. J Bacteriol 2002; 184: 2319-2323.
- Li Y, Mima T, Komori Y et al. A new member of the tripartite multidrug efflux pumps, MexVW-OprM, in Pseudomonas aeruginosa. J Antimicrob Chemother 2003; 52: 572-575.
- Sanchez P, Alonso A, Martinez JL. Cloning and characterization of SmeT, a repressor of the Stenotrophomonas maltophilia multidrug efflux pump SmeDEF. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46: 3386-3393.
- Nishino K, Yamada J, Hirakawa H, Hirata T, Yamaguchi A. Roles of TolC-dependent multidrug transporters of Escherichia coli in resistance to β-lactams. Antimicrob Agents Chemother 2003; 47: 3030-3033.
- Rouquette-Loughlin C, Dunham SA, Kuhn M, Balthazar JT, Shafer WM. The NorM efflux pump of Neisseria gonorrhoeae and Neisseria meningitides recognizes antimicrobial cationic compounds. J Bacteriol 2003; 185: 1101-1106.
- i X-Z, Poole K, Nikaido H. Contributions of MexAB-OprM and an EmrE homologue to intrinsic resistance of Pseudomonas aeruginosa to aminoglycosides and dyes. Antimicrob Agents Chemother 2003; 47: 27-33.
|
